MagCapture™ 外泌體提取試劑盒


產品編號 產品名稱 產品規格 產品等級 產品價格
293-77601 MagCapture™?Exosome?Isolation?Kit?PS
Exosome外泌體提取試劑盒PS?
10次用
299-77603 MagCapture™?Exosome?Isolation?Kit?PS
Exosome外泌體提取試劑盒PS
2次用 for?Genetic?Research?
016-27061 Anti?CD63,?Monoclonal?Antibody?(3-13)?
?抗CD63單抗(3-13)?
20uL
012-27063 Anti?CD63,?Monoclonal?Antibody?(3-13)?
抗CD63單抗(3-13)
100uL
CAC-SHI-EXO-M02-50UL Anti?CD63?for?Exosome?Isolation
CD63?外泌體提取抗體?
50uL
CAC-SHI-EXO-M01-100UL Anti?CD9?for?Exosome?Isolation
外泌體分離抗體CD9?
100uL
CAC-SHI-EXO-M02-100UL Anti?CD63?for?Exosome?Isolation
外泌體分離抗體CD63?
100uL
CAC-SHI-EXO-M03-100UL Anti?CD81?for?Exosome?Isolation
外泌體分離抗體CD81?
100uL
CSR-SHI-EXO-K010 ExoTrap?™?Exosome?Isolation?Spin?Column?Kit,?for?Protein?Research?
外泌體分離親和柱套裝,蛋白研究用?
kit
290-35591 Magnet?Stand
??MagCapture系列磁珠捕獲用磁力架?
1個

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒新型親和法外泌體提取試劑盒

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS

 

  MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS采用磷酯酰絲氨酸(PS)親和Tim4蛋白固化磁珠(PS親和法)的方法可以簡便快捷地提取高純度的完整外泌體和其他細胞外囊泡(EVs)。如果想要得到更高純度的外泌體,請使用10,000×g離心后的上清。

  該試劑盒使用含有EDTA的中性洗脫緩沖液將外泌體完整洗脫下來,所提取的完整外泌體和其他EVs可用于不同實驗,包括電鏡分析(TEM)、納米粒子追蹤(NTA)分析、投喂實驗、分子組成(蛋白質、脂質、核酸等)分析等。

 


◆膜表面磷酯酰絲氨酸(PS)親和法


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒


  Tim4蛋白固化磁珠,在金屬離子存在的條件下親和細胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸(PS),然后使用含有EDTA的洗脫液進行洗脫,捕獲高純度的完整細胞外囊泡

◆優點?特色

 MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

 

使用新型親和提取方法


● 通過PS親和分子回收

● 低背景值

● 在中性條件下通過螯合試劑進行溫和洗脫

※ 可獲得高純度,完整的外泌體

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

無需進行超離

● 使用磁珠改進了操作

● 流程優化

※ 高重復性


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

與其他提取方法相比

方法

外囊泡純度

囊泡狀態

可操作性

回收量

PS親和法

■■■

完整

簡便穩定

■■■

超速離心法

■■

完整

簡便

■■

聚合物沉淀法

完整

簡便快捷

■■■■

密度梯度離心法

■■■■

完整

復雜

■■

抗體親和法

■■■

不完整

簡便穩定

■■

樣品類型:細胞培養上清、血清、血漿、尿液等。


● 可以純化高純度完整的細胞外囊泡

● 可以從細胞上清液、血清、血漿和尿液中純化外囊泡

● 重復性高,回收量穩定

● 簡易操作(約3.5小時)

● 啟用多個樣品(無需超速離心)

產品列表


產品名稱

包裝規格

保存條件

MagCapture™
Exosome Isolation Kit PS

10次

(產品編號:293-77601)

2次

(產品編號:299-77603)

2-10°C

試劑盒成分

(1) 鏈霉親和素磁珠
(2)生物素標記的外泌體捕獲
(3)外泌體捕獲免疫固定緩沖液
(4)外泌體結合增強劑(×500)
(5)洗滌緩沖液
(6)外泌體洗脫緩沖液
(7)反應管

<10 次>
 600 μL×1 管
 100 μL×1 管
 35 mL×1 瓶
 500 μL×1 管
 75 mL×2 瓶
 5 mL×1 瓶
 22 管

<2 次>
 120 μL×1 管
 20 μL×1 管
 7 mL×1 瓶
 100 μL×1 管
 30 mL×2 瓶
 1 mL×1 瓶
 1 管

 *每套試劑盒能完成5次回收實驗,即實際使用量為10×5次/Kit與2×5次/Kit

案例?應用


從血清、血漿、尿液中提取的細胞外囊泡的分析


從人血清中提取外泌體的產量比較

  使用該試劑盒,超離法和抗體親和法提取人血清的外泌體,接著用CD9和CD63抗體進行免疫印跡實驗。


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒


● 檢測抗體

      抗CD9兔多抗,System Bioscience公司

      抗CD63兔多抗,System Bioscience公司

● 免疫印跡(WB)數據

      各樣品結果相當于150μL的血清樣本。從100μL提取物中取出15μL,添加5μL的4×SDS樣品緩沖液,全部上樣。

 

從人EDTA血漿中提取外泌體

  分別從1mL的EDTA血漿、EDTA血漿(超濾更換緩沖液)、人血清中提取外泌體,進行WB檢測(抗Flotillin2抗體)。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

● 檢測抗體

      抗Flotillin-2小鼠單抗(29/Fotillin-2),BD Bioscience公司

● 使用樣品量

      各1mL

● 免疫印跡(WB)數據

      各樣品結果分別對應150μL樣品量。從100μL提取物中取出15μL,添加5μL的 4×SDS樣品緩沖液,全部上樣。

 

從人尿液中提取外泌體的回收量比較

  1mL人尿液分別通過本試劑盒、聚合物沉淀法、超離法進行外泌體回收,并做免疫印跡(WB)檢測(抗CD9抗體)。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒


● 檢測抗體

      抗CD9兔多抗,System Biosciences公司

● 使用樣品量

      各1mL

● 免疫印跡(WB)數據

      各樣品結果分別對應150μL尿液樣品。從100μL提取物中取出15μL,加入5μL的 4×SDS樣品緩沖液,全部上樣。

 


◆與傳統沉淀法的功能比較實驗


  分別用本試劑盒、超離心法和聚合物沉淀法從K562(人慢性骨髓性白血病)細胞培養上清(無血清培養上清或10%Exosome-depleted FBS添加培養基)提取外泌體,分別比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS【PS親和法】


  按照試劑盒的操作說明(反應時間:3小時),從1mL經過離心處理(10,000×g,30min)的K562細胞培養上清(無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1)中提取外泌體。

超速離心法

  將10mL經過離心處理(10,000×g,30min)的K562細胞培養上清(無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1)進行超離(110,000×g,70min),用TBS緩沖液重懸沉淀物后,再進行超離(110,000×g,70min),回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

  從1mL經過離心處理(10,000×g,30min)的K562細胞培養上清(無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1)中,按照市售的A公司產品的操作說明(靜置時間:過夜)提取外泌體。

※1:110,000×g離心2小時,在不吸到沉淀的前提下回收上清。

 

比較提取的外泌體的透射電子顯微鏡(TEM)分析結果和納米粒子追蹤(NTA)分析結果

  分別用本試劑盒、超離法、聚合物沉淀法提取外泌體,用NanoSight LM10檢測外泌體片段的粒子直徑。另外,用最終濃度為2%的多聚甲醛固定提取到的外泌體片段(2~4×1010 particles),在透射電子顯微鏡進行分析。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

電子顯微鏡圖像 數據提供:金澤大學 醫學系 華山教授、大阪大學 iFReC 中井先生


MagCapture™可提取到很多100nm左右的粒子,在透射電子顯微鏡中也可以確認到很多細胞外囊泡。

 

K562細胞培養上清提取的外泌體回收量和純度的比較(無血清培養基)

  用PS親和法、超離法和聚合物沉淀法從K562 細胞培養上清(無血清培養基)獲得樣品進行電泳。接著用銀染色和WB法(CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗體)進行實驗。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

回收量,不是回收率

● 檢測抗體

     抗CD63小鼠單抗(MEM-259)

     抗Flotillin-2 小鼠單抗  (29/Flotillin-2),BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠單抗 (25/Lamp-1),BD Bioscience公司

 


K562細胞培養上清提取外泌體的回收量和純度的比較(10%FBS-添加培養基)


  用MagCapture™外泌體提取試劑盒 、超離法和聚合物沉淀法,從K562 細胞培養上清(10% 去外泌體 FBS補充培養基)獲得樣品進行電泳,用銀染法和WB法(CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗體)進行實驗。同時,對外泌體提取片段進行質譜測定,比較所有測定的多肽中來自K562細胞的人來源多肽的比例(由于添加到細胞培養基的FBS中牛蛋白聚集體是混雜的,所以人來源多肽的比率會下降)。


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒


● 檢測抗體

     抗CD63小鼠單抗(MEM-259)

     抗Flotillin-2小鼠單抗 (29/Flotillin-2),BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠單抗(25/Lamp-1),BD Bioscience公司

     健康人血清來源的外泌體中提取miRNA和mRNA的回收量比較


實驗數據

①運用不同方法提取外泌體并比較從中提取的microRNA和mRNA的回收量

通過超離法和PS親和法將EVs從正常人血清中分離,然后使用microRNA提取試劑盒(產品編號295-71701)提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA,并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

相比超離法,PS親和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高產量。


②運用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比較

  運用PS親和法將EVs從正常人血清中分離,然后使用microRNA提取試劑盒(產品編號295-71701)或基于AGPC法的試劑提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA,并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

對比AGPC法,使用microRNA提取試劑盒更能有效提取PS親和法純化所得EVs中的microRNA和mRNA


◆外泌體蛋白質組學分析


<實驗內容及結果>

  分別利用PS親和法、超離法、聚合物沉淀法,從含10% FBS(不含外泌體)的K562細胞培養上清液中提取外泌體。將提取樣品用10%聚丙烯酰胺電泳分離,剪切出全部的蛋白質條帶。然后在凝膠內進行消化,用LC-MS對蛋白質進行檢測。對上述三種方法提取的外泌體進行蛋白質組合的相關性比較。

比較通過MASS分析鑒定的前10個蛋白質

白色柱:源自外囊泡的人類蛋白質

灰色柱:來自FBS的牛蛋白污染物

紅 色:來自外囊泡的標記蛋白

樣品:K562細胞培養基(含有10%去除外泌體胎牛血清)


PS親和法

超離法

聚合物沉淀法

1

71kDa熱休克同源蛋白

(Heat shock cognate 71kDa protein)

DNA依賴蛋白激酶催化亞基基因

(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)

補體C3

(Complement C3)

2

膜聯蛋白A6

(Annexin A6)

鐵轉蛋白受體1

(Transferrin receptor protein1)

α2-巨球蛋

(Alpha-2-macroglobulin)

3

鐵轉蛋白受體1

(Transferrin receptor protein1)

血清白蛋白

(Serum albumin)

纖連蛋白

(Fibronectin)

4

V-ATP酶A亞基

(V-type proton ATpase catalytic subunit A)

ATP依賴RNA解旋酶

(ATP-dependent RNA helicase A)

血清白蛋白

(Serum albumin)

5

浮艦蛋白-2

(Flotillin-2)

微管蛋白β5

(Tubulin beta-5 chain)

血小板反應蛋白-1

(Thrombospondin-1)

6

程序性細胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein)

71kDa熱休克同源蛋白

(Heat shock cognate 71kDa protein)

補體C4

(Complement C4)

7

細胞表面抗原4F2重鏈

(4F2 cell-surface antigen heavy chain )

脂肪酸合成酶

(Fatty acid synthase)

α-1抗蛋白酶

(Alpha-1-antiproteinase)

8

膜聯蛋白A1

(Annexin A1)

細胞表面抗原4F2重鏈

(4F2 cell-surface antigen heavy chain)

載脂蛋白-β-100

(Apolipoprotein-β-100)

9

220kDa激酶D相互作用底物

(Kinase D-interacting substrate of 220kDa)

U5小核核糖核蛋白的解旋酶

(U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase)

胎兒血紅蛋白亞單位

(Hemoglobin fetal subunit beta)

10

膜聯蛋白A2

(Annexin A2)

β4微管蛋白

(Tubulin beta-4B chain)

β5微管蛋白

(Tubulin beta-5 chain)

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

成對組合相關性比較


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

 


應用數據


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒


Protein Assay BCA Kit檢測外泌體的蛋白質濃度


  Protein Assay BCA Kit是利用二辛可寧酸(BCA)定量檢測溶液中的蛋白質濃度的試劑盒,是蛋白質定量檢測法中最通用的方法。其原理為,堿性條件下的蛋白質Cu2+離子被還原為Cu+。Cu+與BCA形成絡合物,即產生紫色螯合物,蛋白質濃度與紫色螯合物顏色深淺有關,通過測定562nm處的吸光度,并與標準曲線做比照,即可定量溶液中的蛋白質濃度。

利用MagCapture™外泌體提取試劑盒從細胞培養上清液中提取外泌體,通過Protein Assay BCA Kit高靈敏的檢測外泌體中蛋白質濃度。


【實驗內容及結果】

  將通過MagCapture™外泌體提取試劑盒提取的25μL外泌體溶液分注于96孔板中,加入 Protein Assay BCA Kit中試劑A和試劑B混合液200μL。之后60℃孵育30分鐘,檢測560nm吸光度(圖1)。結果表明,通過Protein Assay BCA Kit的高靈敏度檢測,可測定提取后外泌體中蛋白質濃度。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

圖1. Protein Assay BCA Kit 檢測BSA的檢量線和提取的外泌體蛋白質濃度的檢測

 

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌體蛋白質濃度相當低,因此BCA測定時不要稀釋樣品。

①    將BSA標準溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL和空白對照,分別每孔25μL加到96孔板中。

②    分別把提取的外泌體和洗脫緩沖液(空白)按照每孔25μL加入96孔板。

③    把200μL Protein Assay BCA Kit(產品編號:297-73101)的試劑A盒試劑B混合液(A:B=50:1)加入放有樣品的孔板中。

④    60℃孵育30分鐘

⑤    室溫條件下降低孔板溫度

⑥    測定560nm的吸光度

 

產品編號

產品名稱

包裝

297-73101

Protein Assay BCA Kit

蛋白測定試劑盒(二喹啉甲酸)

250次用

015-25613

2 mg/mL Albumin Solution   from Bovine Serum

2mg/mL 牛血清蛋白溶液

1mL×10

 


◆外泌體的標記和Hela細胞導入實驗


【實驗概要】

用PKH67(Sigma公司)標記MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的細胞外囊泡, Hela細胞導入確認


<外泌體PKH67標記>

1. MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取外泌體(實驗當天從K562細胞培養上清液提取外泌體)

2. 用BCA Assay和NanoSight檢測樣品的蛋白質濃度和粒子濃度

3. 將相當于5μg*蛋白量的外泌體樣品溶液分裝至1.5mL管中。

*請配制合適的使用量

4. 將2.0μL的PKH linker溶解在0.25mL的DiluentC中。…4×Dye solution*

*請配制合適的使用量

5. 添加1/3樣品量的4×Dye solution至樣品中,混合后在室溫中孵育5-10分鐘。

6. 根據附帶的操作說明用PBS平衡Exosome Spin Columns (MW 3000)(Thermo公司)。

7. 將100μL樣品分別加入上述平衡后的旋轉柱*中,離心(最大添加量:100μL)。

*準備必需的支數。

8. 將外泌體溶液*加入到已經接種好Hela細胞的培養皿中,24小時后用顯微鏡觀察并利用流式細胞儀進行分析。

*根據實驗調節外泌體添加量


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

圖1. PKH標記外泌體的細胞捕獲觀察


從16mL K562培養上清液中超濾濃縮得到4mL培養上清液作為樣品,通過PS親和法提取外泌體。

●      提取的外泌體蛋白質濃度:22.3ng/μL

●      粒子濃度:1.2×108 particles/mL

將上述標記的外泌體溶液全部加入接種好的Hela細胞中,24小時后用熒光顯微鏡(左)和流式細胞儀(右)檢測捕獲情況。

Opti-MEM:取相同量用PKH標記后添加到細胞中作為陰性對照。


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

 


◆細胞培養上清?血清?血漿的預處理操作


  樣品預處理:對樣品進行1,200×g離心操作※1。如果要得到更高純度的外泌體,則按照下述步驟對樣品進行10,000×g離心操作※2。

  下文是細胞培養上清、血清/血漿的預處理方法。其他體液樣品的預處理操作,請參考血清/血漿的實驗步驟,做適當調整。


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒


更換緩沖液(限制過濾)操作

用50 mL TBS 緩沖液對1 mL 已經經過離心處理的EDTA 血漿樣品進行緩沖液更換。

1. 把19 mL TBS 加進VivaSpin20(100K)中。

2. 把1 mL 離心過的EDTA 血漿上清添加在第1. 的VivaSpin20(100K)中,

 混勻。

3. 把第2. 的VivaSpin20(100K)在4℃下進行離心處理。

4. 減少上線的液體后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 緩沖液。

5. 4℃下離心處理。

6. 減少上面的液體后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 緩沖液。

7. 4℃下離心處理。

8. 減少上面的液體后,在VivaSpin20(100K)中追加11 mL TBS 緩沖液。

9. 4℃下離心處理直至樣品液量達到1 mL 以下。

10. 進行提取。

 


◆MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 操作步驟


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

 

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PS親合法

  通過使用T細胞免疫球蛋白結構域和粘蛋白域包含蛋白4Tim4)分離高度純化的外泌體。Tim4是在巨噬細胞上表達的I型跨膜蛋白,其強烈結合磷酯酰絲氨酸,不僅顯示在凋亡細胞上,而且顯示在外泌體和微泡。使用Tim4蛋白,其特異性結合顯示在外泌體表面上的磷酯酰絲氨酸。因為結合是Ca2+依賴性的,完整的外泌體可以通過添加Ca2+螯合劑容易地從Tim 4釋放。值得注意的是,利用PS親和法提取的外泌體純度之高可以用過質譜顯示的。還用于從細胞條件培養基沉淀中分離大外泌體和通過ELISA、流式細胞術對外泌體的靈敏定量。這些結果表明通過Tim4蛋白純化的有用性表征Evs的真正功能。

Wataru Nakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez etl.A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles[J]Nature, Scientific Reports 6, Article number: 33935 (2016). doi:10.1038/srep33935

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

和光外泌體提取試劑盒宣傳頁

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

Wako外泌體英文版說明書.pdf

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MagCapture™ 外泌體提取試劑盒成功研發提取高純度外泌體方法

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒外泌體提取試劑盒中文說明書

操作流程



樣品制備流程(步驟1)


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

外泌體捕獲固定流程(步驟2)

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

親和提取流程(步驟3—5)


MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

外泌體提取血漿樣品前處理步驟


使用TBS緩沖液進行緩沖液交換

1、向VIVASPIN 20(100K)中添加19mL TBS緩沖液。

2、將1ml血漿添加到(步驟1)的VIVASPIN 20(100K)中并混合。

3、離心(步驟2)中的VIVASPIN 20(100K)。 (離心條件參考使用說明書)

4、當上層液體下降時,添加10mL TBS緩沖液到(步驟3)的VIVASPIN 20(100K)中。

5、離心。

6、當上層液體下降時,添加10mL TBS緩沖液到(步驟5)的VIVASPIN 20(100K)中。

7、離心。

8、當上層液體下降時,添加11mL TBS緩沖液到(步驟7)的VIVASPIN 20(100K)中。

9、離心VIVASPIN 20(100K),直到樣品體積變為1mL。

該方案共計使用50mL的TBS緩沖液。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒

常見問題



? 關于試劑盒的規范、性能


Q1 本試劑盒使用了抗體

A1 沒有使用抗體。使用了與金屬離子結合和與磷酯酰絲氨酸(PS)結合的蛋白。

 

Q2 用此款試劑盒可提取什么樣胞外囊泡呢

A2 外泌體和大型細胞外囊泡(微小泡)。

Q3 外泌體和微泡的區別是?

A3 外泌體,是來源于晚期胞內體,直徑為40-100nm的細胞外囊泡。微泡來源于細胞膜,直徑100-1000nm的細

      胞外囊泡。

 

Q4 外泌體和微泡能可以分別純化嗎?

A4 可以。同時純化的情況下,1200×g離心取上清液。純化外泌體的情況下,10000×g離心取上清液。只純化微

         泡的情況下,10000×g離心,沉淀置于TBS制成懸濁液備用。樣品的前處理請參考操作說明書。

 

Q5 外殼型病毒也能回收嗎?

A5 能。外殼性病毒膜表面也有PS,混入外殼性病毒的樣品,所有PS都能回收。需要分離的情況下,使用本試劑盒

        回收后,需要用與病毒或者外泌體特異性抗原的抗體純化。

 

Q6 所有的外泌體都會暴露磷脂酰絲氨酸(PS嗎?

A6 尚未得到實驗驗證。通過分析外泌體的膜脂成分證實,有幾種細胞(小鼠少突膠質細胞)來源于外泌體。因

        此,不會暴露PS。另一方面有可能存在少量PS暴露的外泌體,而此款試劑不能純化這種外泌體。但是,使用

        該試劑純化到的外泌體,已確認有多個外泌體標記蛋白,與以單一類型的表面標記蛋白作為抗原的傳統親和方

        法相比,以膜脂成分為抗原的該試劑能取得更多種類的外泌體。另外,雖然識別表面標記蛋白的抗體可能無法

        識別不同動物來源的抗原,但是該試劑能解決這一問題(人類、小鼠、牛等都能應用)。而且已驗證了可以純

        化超速離心時需沉淀才能回收的外泌體。

 

Q7 該試劑盒的品是什

A7 使用細胞培養上層清液、血清或尿液效果顯著。如果血漿中添加了螯合劑(比如EDTA)和檸檬酸,原理上無

        法分離外泌體。若要回收,可通過超濾更換緩沖液來回收。具體步驟請看相關資料。由于肝素處理過的血漿回

        收率低,從血液樣本中回收請使用血清。另外有客戶成功從血漿、腦脊髓液中回收外泌體。

 

Q8 一次能回收多少外泌體

A8 根據樣品的種類和數量有很大的差異,據研究所實驗記錄,在一次的分離中最多能回收30μg蛋白質(通過

        BCA法檢測)、1-2×1010粒子(通過納米技術檢測)。(K562培養基中的莫能菌素能促進外泌體分泌,可取

        5mL培養上清液進行回收)。

        1 mL正常人混合血清能回收5×109顆粒(通過納米技術檢測)。

 

? 與傳統法的比較


Q9 與超速離心法相比好處在哪?

A9 與超速離心法相比,本試劑盒能更簡便、重復性好、高效地回收高純度外泌體。也能回收超速離心法無法沉淀

        的外泌體。

 

Q10 與傳統抗體親和法相比,PS親和的優勢是什么?

A10 采用傳統的抗體親和法是用變性劑進行洗脫,此款試劑盒是在中性環境下用螯合劑來洗脫的,能完整回收外

          泌體,不會混入非特異性吸附物,能獲得高純度外泌體,提取純度更高。傳統的抗體親和法只能特異性識別

          一種外泌體表面Marker蛋白質,而本試劑盒是特異性識別膜脂質成分,更能廣泛獲得外泌體。有事例表明識

          別表面Marker蛋白質抗體不能識別不同動物物種的抗原,而本試劑盒能在大范圍的動物物種中運用(人,

          小鼠,牛等都有報道)。

 

Q11 與其他方法相比回收的度如何?

A11 與傳統沉淀法(超速離心法、多聚物沉淀法)相比,純度更高。與超速離心法和密度梯度離心法相結合的方

          法相比,能簡便地獲得同等高純度的外泌體。(原因:采用抗體的傳統親和法是用變性劑進行洗脫,因此很

          容易混入粒子等非特異性吸附物。然而此款試劑盒是用螯合劑來洗脫的,所以難以混入非特異性吸附物。)

 

Q12 與其他方法相比回收率如何?

A12 與采用抗體的傳統親和法、超速離心法相比,能獲得更高的回收率(低于聚合物沉淀法)。

 

? 關于試劑盒的操作方法、組成


Q13 操作該試劑盒耗多久

A13 (1個小時預處理樣品),該試劑盒Exosome Capture磁珠的固定需要15分鐘,然后3個小時的化學反應,

           最后15分鐘洗脫,總計3小時30分鐘。

 

Q14 本試劑盒需要特別慎重的操作嗎?

A14 Exosome Capture固定化磁珠與樣品反應后的清洗步驟中最后需要去除洗凈液。完全去除后再進行提取。

          提取時在提取液中加入磁珠后,確保磁珠不發生凝集并處于懸浮狀態。

 

Q15 提取液的組成有哪些?

A15 是含有1mM的螯合劑、鹽、防腐劑的Tris基礎溶液。若以上成分阻礙后續分析,請使用超速離心膜

         (Sartorius公司  VivaSpin500,使用100K分子量截留,Code:VS0141)并替換合適的Buffer。

 

Q16 Exosome Capture 固定后磁珠可以循環利用嗎?

A16 可以。為了能夠高效回收樣品中的外泌體,試劑盒可完成5次回收實驗。試劑盒里的緩沖液只含5次純化的

          量。1mL體積以上樣本建議進行濃縮后再回收,純化時可進行反復抽提,提高純化效率。詳情參考操作說

          明書。

 

Q17 Exosome Capture固定化磁珠能保存嗎?

A17 可以。洗脫出外泌體后的磁珠需再使用,用試劑盒附帶的 Washing buffer或自制的TBS冷藏保存。

 

Q18 實驗要留到第二天需要做什么步驟?

A18 Exosome Capture固定化磁珠與樣品的反應步驟(反應時間3小時)可以過夜(置于4℃下)。

 

? 關于樣品用量


Q19 樣品純化所需的最低量是?

A19 使用旋轉器的需要500μL以上,使用離心管混合器的需要100μL。樣品量更少的情況下加TBS到所需最低量后

          再使用Exosome Capture固定化磁珠。

 

Q20 大量的樣品能回收嗎?

A20 可濃縮后再回收。如果樣品是培養上清,可以從體積50毫升的樣品中回收外泌體。離心分離預處理后,取

          50mL上清液超離濃縮至1mL(推薦Sartorius Viva Spin20 使用100K分子量截留、Code:VS2041)。無

          血清培養基和添加了10% FBS的培養基也可以收集外泌體。詳情參照操作說明書。因為血清樣品無法濃縮,

          最多只能用10mL的樣品。但是大于1mL的血清回收率低,建議反復提純。

 

? 關于外泌體提取后的分析


Q21 外泌體中含有什么?

A21 含有蛋白質、脂質、核酸(DNA、microRNA、mRNA)等。

 

Q22 提取后的胞外囊泡可以用什方法檢測?

A22 因為能得到完整的細胞外囊泡,可以使用所有的分析方法。

         (例)蛋白質分析:蛋白質電泳、免疫印跡、質譜分析、流式細胞術、ELISA等

      核酸分析如:定量PCR、微陣列(生物芯片)、新一代測序等

      粒子分析:電鏡分析,納米位點分析(NTA)等

      功能分析:體內外的用藥實驗等

 

Q23 提取后的細胞外囊泡(EVs)能直接添加到細胞使用中嗎?

A23 可以使用,但有需要注意的地方。如果提取液的成分有影響,參考Q15替換合適的Buffer。使用離心過濾

          部件。

         (Millipore公司ΜLtrafree – MC, GV 0.22μm 已滅菌、Code:UFC30GV0S)除菌。

 

Q24 電鏡分析需要外泌體的量是多少?

A24 能用電鏡觀察到2-4×1010的粒子(通過納米技術檢測)。

 

Q25 提取出的細胞外囊泡的保存條件是?

A25 冷藏、冷凍保存。長期保存需要放到-80℃。

          為避免凍結溶解,凍結保存推薦細分后保存。

 

Q26 如何做回收的外泌體提取液的免疫印跡?

A26 本公司研究所從回收的100 μL提取液抽取15 μL,加入5 μL 4×SDS樣品Buffer,共20μL的樣品全量上樣進行

          SDS-PAGE。用量與宣傳冊上的免疫印跡的樣本量一致。


Q27 Exosome質譜檢測的步驟是?

A27 外泌體提取→SDS-PAGE與膠內酶切→通過LC-MC/MS進行蛋白質組學分析


 

? 關于外泌體標記


Q28 用該試劑盒提取出來的囊泡怎判斷是外泌體呢

A28 根據表面抗原的抗體(WB)、電子顯微鏡、密度梯度離心、納米粒度測量(如NanoSight LM10)等來

          驗證。


Q29 外泌體分離后用免疫印跡法確標記蛋白是什么?

A29 CD9, CD63, CD81, Frotillin-2, Lamp-1等。

 

? 相關產品


Q30 有在售和光檢測外泌體用的抗體

A30 本公司當前銷售以下抗體。

          Anti CD9 for Exosome Isolation(Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M01-50UL

          Anti CD81 for Exosome Isolation(Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M03-50UL

          Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)(Wako Cat. NO.012-27063

          Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)(Wako Cat. NO.016-27061

 

Q31 有可以從分離囊泡里提RNA試劑

A31 有。可使用microRNA Extractor SP Kit(295-71701)比AGPC法更能高效提純RNA。

 

Q32 售磁支架嗎?

A32 有的。Wako品牌,產品編號290-35591,MagCapture系列磁珠捕獲用磁力架。”

 

Q33 該技術專利是什么?

A33 已申請PCT專利。

Q34 加入什么金屬離子?

A34 鈣離子

 

Q35 血漿提取方法是?

A35 請查看相關資料

Q36 試劑盒中的22支反應管有什么特殊之處嗎?用普通的1.5mL離心管可以嗎?

A36 該試劑盒中的反應管使用特殊材質,可減少磁珠吸附,該反應管可單賣

A36 BMBio BM-15 Ring Lock Tube 1.7mL 500 tubes/box 1。

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